مهندسی اپتیک ولیزر

اسکن میکروسکوپی لیزری هم کانون

اسکن میکروسکوپی لیزری هم کانون ابزاری مفید برای بازسازی سه بعدی و بدست آوردن تصاویر سه بعدی با کیفیت بالاست. خصوصیت کلیدی میکروسکوپی هم کانون توانایی آن در ایجاد تصاویر بدون کدورت از نمونه ها ی ضخیم در عمقهای مختلف است. اصول این نوع خاص از میکروسکوپی توسط ماروین مینسکی در سال1953 کامل شد اما هنوز سی سال دیگر زمان لازم بود تا لیزر بتواند بعنوان یک منبع نور نقطه‌ای برای میکروسکوپی هم کانون و بعنوان روشی استاندارد در اواخر دههٔ 1980 مورد استفاده قرار بگیرد.

در اسکن میکروسکوپی لیزری هم کانون یک پرتو لیزری از روزنهٔ منبع نوری گذشته و سپس توسط عدسی های شیئی به حجم کانونی کوچکی بر روی یک نمونهٔ فلورسانت متمرکز می‌شود. سپس مخلوطی از نور فلورسانت تابیده شده و لیزر بازتابیده شده از نقطهٔ مورد تابش قرار گرفته توسط عدسی های شیئی جمع آوری می‌شود. یک جدا کنندهٔ طیفی مخلوط نور را با گذر انتخابی نور لیزری و بازتاباندن نور فلورسانت به دستگاه جداساز از هم مجزا می‌کند. پس از گذر این نور، نور فلورسانت توسط یک وسیلهٔ جدا کنندهٔ نور( لولهٔ تشدید کنندهٔ نور و یا دیود بهمن نوری) باعث تغییر سیگنال نوری به یک سیگنال الکترونیکی شده که در مرحلهٔ بعد این سیگنال الکتریکی توسط رایانه قرائت می‌شود.

روزنهٔ جداساز از ورود نور به اصطلاح تنظیم نشده یعنی نور فلورسانسی که از سطح کانونی عدسی های شیئی منشاء گرفته ممانعت به عمل می‌‌آورد. پرتوهای نوری از زیرسطح کانونی قبل از رسیدن به جداساز متمرکز می‌گردند و بخش عمده‌ای از آنها بواسطهٔ متمرکز نبودن بر روزنهٔ جداساز حذف می‌گردند و بقیهٔ پرتو ها به جداساز میرسند. در این روش بخش خارج از کانون قسمت بالا و پایین به میزان زیادی کاهش میابد که نهایتا باعث تشکیل تصویری واضح تر نسبت به روش های میکروسکپی سنتی می‌گردد. نور جداسازی شده‌ای که از بخش نورانی نمونه منشاء گرفته در تصویر حاصله بشکل یک نقطه نمایش داده می‌شود. بنابراین تصویر نهایی ردیف به ردیف و نقطه به نقطه تشکیل می‌گردد و درخشش نهایی تصویر حاصله با شدت نور جداسازی شدهٔ فلورسانت مطابقت خواهد داشت. پرتو سرتاسر نمونه را بشکل صفحه‌های افقی و با استفاده از آینه‌های نوسانگر خود مهار شونده اسکن می‌کند. این روش اسکن( پویش) کردن معمولا امکان ایجاد واکنشهای نهفتهٔ کمتری دارد و با کم شدن سرعت آن نسبت قابل قبول تری از سیگنال به خطا را نتیجه می‌دهد و نهایتا تباین و کیفیت بالاتری نتیجه می‌دهد. اطلاعات لازم را می‌توان با صفحه‌های کانونی متعدد و با تغییر سطح میکروسکوپ به سمت بالا و پایین بدست آورد. رایانه می‌تواند یک تصویر سه بعدی از نمونه را بوسیلهٔ سری زدن تعداد زیادی از تصاویر دو بعدی متوالی ایجاد کند.

بعلاوه میکروسکوپی کانونی پیشرفت زیادی را در کیفیت نهایی و ظرفیت برش نوری سری مناسب فراهم کرده که این امر حتی در نمونه‌های زندهٔ با حداقل آماده سازی قابل مشاهده است. با توجه به اینکه این روش وابسته به فلورسانس است، نمونه ها معمولا بایستی با رنگهای فلورسانس رنگ آمیزی شوند. با اینحال بایستی توجه کرد که غلظت مواد خارجی به حدی کم باشد که بر روی ساز و کار طبیعی زیستی تاثیر منفی نگذارد. برخی ابزار ها حتی قادر به ردیابی یک ملکول خاص فلورسانس نیز میباشند. همچنین روشهای ترنس ژنیک می‌توانند ارگانیسمهایی را بوجود بیاورند که خودشان ملکول فلورسانس تولید کنند.(مثل پرونئینهای سبز فلورسانت).